Časopis Myslivost

V centru výzkumu genetiky vlků

Myslivost 4/2020, str. 22  Tobias Thimm
V Gelnhausenu sídlí výzkumný ústav Senckenberg, kde jsou zkoumány všechny vzorky vlčí DNA, které byly odebrány ze střežených zvířat v Německu. Ale co přesně se v tomto ústavu provádí a jaké metody se používají? Tobias Thimm, redaktor časopisu Wild und Hund navštívil předního vědce zkoumajícího genetiku vlků, Dr. Carstena Nowaka, přímo ve výzkumném zařízení. Vzhledem k tomu, že se i v České republice vedou vzrušené diskuze o hybridizaci vlků se psy, požádali jsme německé přátele o možnost převzetí článku i pro časopis Myslivost.

 

Výzkumný ústav schovaný v obci Gelnhausen (okres Main-Kinzig) se nachází v nenápadné budově z načervenalého pískovce. Zvenku nic nenasvědčuje, že zde probíhají velmi důležité genetické analýzy vlčí DNA. Barevné otisky tlapek na podlaze, které vás navedou k laboratoři, byly tím prvním znamením, že jsem na správné adrese. V potemnělých chodbách kolem mě pobíhají vědci v ležérních dřevorubeckých košilích a s ošuntělými hrnky s kávou. Je tady až nepříjemně chladno a odněkud ke mně doléhá štěkot psů.

V jedné z mála otevřených kanceláří sedí Dr. Carsten Nowak. Obrazovka jeho počítače je poseta barevnými sekvencemi DNA. Vědec je zcela ponořen do svých studií. Rychle si přes sebe přehodí bílý plášť a upraví si na nose své černé brýle s tlustými obroučkami. Rodák z Hesenska Nowak na stole rozkládá pořadač s barevnými nákresy a diagramy. „Nemějte strach, k tomu, abyste pochopil, co přesně v našem výzkumném ústavu děláme, stačí základní znalosti genetiky,“ usmívá se Nowak.

Od roku 2008 až dosud pracuje v pobočce ústavu Senckenberg v Gelnhausenu. Výzkum se zde kromě genetiky soustředí také na ekologii vod. Oddělení patří k ústavu Senckenberg ve Frankfurtu, kde má své sídlo také stejnojmenné přírodovědné muzeum.

V roce 2010 výzkumný ústav analyzoval 300 až 400 vzorků ročně, v roce 2018 už jich bylo 3000. Specifikem těchto výzkumů je, že většina analýz pochází z materiálů vzorků zabitých hospodářských zvířat, například stop moči, chlupů nebo zbytků slin. Tyto vzorky většinou obsahují jen malá množství DNA, což analýzy ztěžuje. Pro získání přesných výsledků se používají mimořádně citlivé laboratorní metody a veškerá zkoumání se několikrát opakují.

Genetické analýzy mají dva hlavní účely. Určením druhu, jedince a příbuzenských vztahů se získávají důležitá monitorovací data, která pomáhají při identifikaci výskytu vlků a určování počtu smeček. Již brzy po usazení prvních vlků v Německu se ukázalo, že spolehlivé určení zvířete, které ulovilo danou kořist, je mnohdy obtížné a že pro získání jistoty jsou zapotřebí analýzy DNA.

Několikrát týdně dorazí poštou vzorky s vysušenými stěry z roztrhaných ovcí zabalené do malých plastových trubiček a rozpuštěné vzorky v plastových kelímcích naplněných alkoholem z celého území Německa. Poté trvá v průměru deset pracovních dnů, než mohou Dr. Nowak a jeho kolegové oznámit jednoznačný výsledek.

Náklady na analýzu se liší v závislosti na požadavcích odesilatelů. Prosté stanovení druhu u jediného vzorku vyjde přibližně na 100 euro (u kusů, které byly sraženy při nehodě zhruba na polovinu).

Poté, kdy například některý ze zemědělců nahlásí potenciální napadení vlkem poradnímu orgánu nebo místnímu poradci pro vlky v příslušné spolkové zemi, vyráží na „místo činu“ odborník na zabitá zvířata. Odebere až devět vzorků stěrem a předá je příslušnému odbornému orgánu, který – je-li nutná analýza DNA pro určení „pachatele“ – zase výzkumem pověří ústav Senckenberg.

V závislosti na zadání jsou zaslané vzorky podrobovány různým molekulárním metodám. Záleží ale třeba na tom, zda chce zadavatel jen vědět, zda materiál vzorku pochází z vlka či nikoliv, nebo chce získat podrobnější informace například o původu jedince?

K tomuto účelu je k dispozici pět molekulárních metod. Nejdůležitějšími metodami, které se používají prakticky u všech vzorků, jsou analýza mikrosatelitů a určení haplotypu na základě mitochondriální DNA. Tři další metody (SNP čipy, assay amylázy a zkoumání chromozomů Y) se v rámci doprovodného výzkumu provádějí v nepravidelných intervalech a na rozdíl od obou výše zmíněných metod si je neobjednávají úřady.

 

Co poznáme z DNA

 

Pro genetický výzkum je nezbytné pochopení struktury kyseliny deoxyribonukleové (DNA). DNA je genetickým materiálem každé jednotlivé buňky živého organismu a je uspořádána do podoby dvoušroubovice. Oba řetězce šroubovice jsou spojeny páry bází (adenin A a thymin T, cytosin C a guanin G). Pořadí párů bází se označuje jako sekvence bází. Sekvence tvořená třemi páry bází tvoří aminokyselinu, několik aminokyselin poté bílkovinu při předávání dědičné informace. DNA se ukládá v chromozomech uvnitř buněčného jádra, ale i v mitochondriích (buněčných organelách). V závislosti na analytické metodě se používá DNA jádra nebo mitochondriální DNA (viz obrázek 1).

Obr-1.jpg

 

Metoda 1

Mikrosatelity (STR) (DNA jádra)

 

Analýza mikrosatelitů je nejdůležitější metodou při monitorování vlků. Pomocí této metody jsou vytvářeny individuální genetické profily (genetický otisk), rekonstruovány příbuzenské vztahy (a díky tomu také smečky) a je určováno pohlaví.

Tvrzení typu „jedinec GW302m je štěně, samec, narozené v roce 2014, pocházející ze smečky Daubitz“ získáme primárně právě na základě analýzy mikrosatelitů. Kromě toho získáme informace o hybridizaci se psy domácími a díky porovnání znaků zjistíme původy z jiných populací vlků.

Metoda je založena na analýze délky fragmentů (standardní metoda v genetice divokých zvířat). Základem je měření délkových rozdílů v určitých, vysoce variabilních úsecích DNA buněčného jádra. Abychom získali výsledky s vysokou mírou jistoty, dochází většinou ke zkoumání 10 až 20 takových míst.

Spolehlivé rozlišení vlků a psů a analýza hybridizačních událostí je však z důvodu blízké příbuznosti vlků a psů výrazně ztížena a vyžaduje mnoho zkušeností.

Z genetického hlediska jsou psi domácí jednou z mnoha geneticky rozdílných populací vlků. Pokud například porovnáme genetickou podobnost německého vlka s vlky ze Španělska nebo Ruska a se psy domácími, zjistíme určitou podobnost s referenčními skupinami, ale také výrazné rozdíly. To může vést k chybným interpretacím výsledků a vysvětluje to i rozdílné výsledky mezi různými laboratořemi.

Moderní metody, které jsou popsány níže (body 3 a 4), představují řešení problému, protože neměří rozdíly dané populací, jako například vysoce senzitivní mikrosatelity, ale zaměřují se přesně na místa v DNA, v nichž se od sebe vlci a psi geneticky liší.

Obr-2.jpg

 

Metoda 2

Určení haplotypu na základě mitochondriální DNA

 

Tato metoda doplňuje analýzu mikrosatelitů a slouží k odlišení vlka od psa v případech, v nichž je k dispozici příliš málo DNA pro jasný profil mikrosatelitů. Má proto velký význam zejména při zkoumání kořistí, protože často vede k výsledku, u něhož nejsme schopni získat statisticky potvrzený genetický otisk (metoda 1).

Hybridy však touto metodou identifikovat nelze, protože DNA v mitochondriích se dědí pouze přes mateřskou vaječnou buňku.

Na základě získaných haplotypů (varianta sekvence nukleotidů na jednom a tomtéž chromozomu v genomu organismu) lze kromě toho učinit tvrzení o příslušnosti k dané populaci. Haplotyp „HW22“ tak například charakterizuje vlky z Itálie, resp. z oblasti Alp.

Metoda je založena na čtení přibližně 200 stavebních úseků DNA pomocí sekvenování DNA na určitém místě mitochondriální DNA. Získaná sekvence je následně porovnána s referenčními sekvencemi z vlastní a případně i z velkých, online dostupných genetických databází tak, aby se podařilo získat přesný haplotyp (= přesné pořadí sekvence DNA). U německých vlků se podle Nowaka vyskytuje haplotyp „HW01“, méně často pak „HW02“ či „HW22“

 

Metoda 3

SNP čip (DNA buněčného jádra)

 

Tato metoda slouží pro přesné určení stupně hybridizace mezi vlky a psy. Spočívá v tom, že díky mnoha mezinárodním výzkumným projektům je již znám velký počet genomů (= celá DNA jednoho organismu) psů a vlků z nejrůznějších regionů původu. Z nich vědci vybrali mnoho míst v DNA, v nichž se téměř všichni vlci liší od psů domácích.

Společně s partnery z Finska a Itálie se pracovníkům ústavu Senckenberg podařilo dostat 96 těchto míst na jeden kompaktní DNA čip, pomocí kterého lze stupeň hybridizace v populacích vlků nyní určit mnohem přesněji než například pomocí mikrosatelitů.

Těchto 96 míst, takzvaných SNP (= single nucleotide polymorphisms, česky: jednonukleotidový polymorfismus), je v rámci metody zkoumáno až na 96 vzorcích najednou. Dosud bylo mnoho takových čipů testováno na vlcích z Německa, Ruska, Rumunska, Polska a celé řady dalších zemí. Spolehlivá identifikace hybridizačních událostí je možná až do generace F4, která odpovídá třetí generaci zpětných kříženců (= z toho necelých šest připadá na psy).

Vysoké míry selektivity mezi vlky a psy se dosahuje díky diagnostickému charakteru vybraných znaků. Vyššího rozlišení pak lze dosáhnout už jen nákladnými a náročnými výzkumy tisíců SNP nebo kompletních genomů. Takové výzkumy aktuálně probíhají na několika výzkumných zařízeních, například v Dánsku a Slovinsku. I zde se pracuje se vzorky od vlků z Německa.

 

Metoda 4

Assay amylázy (enzym)

 

Tato metoda je zajímavá, protože funguje zcela nezávisle na výběru referenčních vzorků. Díky enzymu amyláze je možné spolehlivě odlišit vlky od psů domácích. Prostřednictvím tzv. „Droplets Digital PCR“ se určuje počet kopií genů pro enzym štěpící škrob – amylázu. Před několika lety bylo zjištěno, že většina psích plemen nese několik variant tohoto genu.

Gen se od dob domestikace lidmi vyvíjel jako adaptace na potravu, která není tvořena výlučně masem. Protože vlci vždy nesou jen dvě kopie tohoto znaku, zatímco psi jich mají několikanásobně více, lze je vzájemně dobře odlišit.

Tato metoda se jako jediná neprovádí přímo v ústavu. Zaměstnanci proto s DNA připravenou v Gelnhausenu jezdí do genetické laboratoře Výzkumného ústavu pro divoká zvířata a ekologii Univerzity veterinárního lékařství ve Vídni.

Obr-4.jpg

 

Metoda 5

Haplotypizace Y (DNA buněčného jádra)

 

Na rozdíl od haplotypizace na základě mitochondriální DNA, při které je pozorována mateřská linie, se v rámci této metody zkoumají znaky psů nacházející se na samčím chromozomu Y, které se dědí výlučně v otcovské linii. Podobně jako assay amylázy se tato metoda používá jako doplňkový znak v rámci doprovodného výzkumu pro účely monitoringu vlků. Technický princip je založen na analýze mikrosatelitů (viz metoda 1).

Protože hybridizace mezi vlky a psy je většinou založena na páření vlčích samic se psy – samci, má většina hybridů sice „vlčí“ mitochondriální haplotyp, ale také typický chromozom Y psa domácího.

 

Mediální kontroverzi a velkou pozornost v Německu vzbuzuje existence vlčích hybridů, tzn. kříženců z páření vlků a psů. Podle Dr. Nowaka však dosud neexistují žádné indicie nasvědčující tomu, že němečtí vlci jsou hybridi, ani že se u nich vyskytuje zvýšený stupeň hybridizace. Vědec však existenci hybridů nepopírá. Podíl kříženců dosahuje podle výsledků ústavu Senckenberg aktuálně méně než jedno procento. Kritici přitom zpochybňují referenční materiál ústavu Senckenberg. Referenční vzorky jsou považovány za významné, protože DNA čistokrevného vlka mohla být odebrána z hybrida – všechny ostatní analýzy by pak křížence identifikovaly jako čistokrevného. Nowak oponuje s tím, že různé analytické metody již dávno nejsou odkázány jen na referenční materiál, např. díky assay amylázy (viz obrázek 4).

Analýza lidské, ale také psí DNA není pro ústavy jako například ForGen z Hamburku, jehož zaměstnanci zkoumají stopy DNA na místech činu již po řadu desetiletí a pomáhají tak s usvědčováním zločinců, ničím novým. ForGen při vlastních výzkumech opakovaně nalézá minimálně indicie nasvědčující existenci hybridů.

Na jedné z přednášek v Dortmundu v lednu 2020 vysvětlovala paní Wurmb-Schwarková lišící se výsledky výzkumných zařízení následovně: „Počítač může přistupovat pouze k datům a vyhodnocovat pouze data, která do něj někdo dříve zadal. Pokud je např. DNA jezevčíka uložena jako vlčí, bude se při budoucích požadavcích na vzorky jezevčí DNA jako výsledek vždy zobrazovat vlčí DNA.“

V závislosti na tom, kdo a co nahrál do které genetické databáze, resp. ke které z databází se přistupuje, je určován výsledek požadavku. Zaměstnanci ústavu Senckenberg proto pro porovnávání sekvencí nepoužívají jen vlastní genetickou databázi, ale i velké, veřejně přístupné vědecké databáze.

Obr-3.jpg

 

Poté, co Nowak objasnil metody a to, co je kritizováno na jeho každodenní práci, chce vědět, jaké starosti si právě kvůli vlkům dělají myslivci. Poté znovu důrazně opakuje. „Lidé prostě musejí pochopit, že v tomto výzkumném zařízení je nám v principu úplně jedno, zda analýzy vzorků potvrdí vlčí DNA nebo nikoliv. Zpracováváme vzorky a výsledek předáváme zadavateli. Dokonce i mezi samotnými zaměstnanci pobočky se vedou kontroverzní debaty o politice související s vlky. Naším úkolem je pouze analýza DNA, nikoliv politika.“

To, že budoucí přístup k vlkům a možným hybridům hraje pro myslivce rozhodující roli, Nowak nezpochybňuje. Takřka tajemně a s úsměvem ještě Nowak dodává, že on sám brzy plánuje složení mysliveckých zkoušek. S poněkud lámaným „Lovu zdar“ se pak loučí, dorazil totiž balík plný nových vzorků. Zdá se, že roztrhaných zvířat je v Německu více než dost. V opačném směru mě pak barevná vlčí stopa bezpečně vyvádí ven z ústavu – z německého centra pro výzkum genetiky vlků.

 

Na závěr ještě pár otázek na dr. Nowaka

 

Interview-Senckenberg_DSC_0122.jpgProč byl jako referenční laboratoř vybrán právě ústav Senckenberg?

 

O tuto funkci jsme se v roce 2009 ucházeli na základě požadavku Spolkového úřadu pro ochranu přírody. Spolkové země se v rámci hlasování pracovní skupiny spolku a spolkových zemí s názvem „Naturschutz 2009“ rozhodly, že jako společné referenční centrum využijí ústav Senckenberg.

 

Ústav Senckenberg hovoří o necelém jednom procentu hybridů. Pořád se však můžeme dočítat zprávy o tom, že ve Švédsku nebo obecně v sousedních státech je prokázán výskyt hybridů. Používají se tam zastaralé analytické metody?

 

To není zcela přesné. Většina sousedních zemí, například Švédsko, dospěje k velmi podobným výsledkům, tedy k míře hybridizace dosahující asi jednoho procenta. Pokud se podíváme na vědecké studie, zjistíme následující. Severně od Alp je míra většinou velmi nízká, hybridizace se tedy jednoznačně vyskytuje, je ale velmi vzácná. Naproti tomu v jižní a východní Evropě, kde je hodně zatoulaných psů, pozorujeme mnohem vyšší míru hybridizace. Jak třeba ukazuje příklad mimořádně vysoké regionální hybridizace v Toskánsku, může se hybridizace stát problémem, který bude nutné brát vážně. Právě proto ale máme moderní genetiku, abychom celý tento proces mohli monitorovat v reálném čase.

 

Už tisíce let dochází k opakovanému páření psů a vlků. Proto přece musejí být vlci nositeli i určité části psí genetické informace?

 

Patrně na celé severní polokouli dochází skutečně již po tisíciletí k páření vlků a psů. Kousek vlčího genetického materiálu tak přechází do psího a naopak. To bylo potvrzeno analýzou celých genomů v několika studiích – v genomech vlků v Evropě a všude na světě nacházíme malé části psí DNA. My v sobě také nosíme části DNA neandrtálců, lední medvědi mají ve své DNA i části DNA medvěda hnědého a těžko byste nalezli prase divoké, které by ve své dědičné informaci nemělo vůbec nic z prasete domácího.

Je to tedy zcela normální a nemá to co do činění s problémem hybridizace, čehož se v případě vlků mnozí obávají. Pokud dochází k častějšímu páření vlků a psů a pokud se hybridi páří zase s vlky a tak dále, mohla by se aktuálně výrazná genetická hranice mezi psy a vlky začít opět stírat. Tomu však v Německu aktuálně nic nenasvědčuje.

 

Od kdy se tedy hybrid stává hybridem?

Hybrid je přísně vzato přímým výsledkem křížení dvou navzájem geneticky oddělených linií, tedy například druhů nebo výpěstků. Často je však do tohoto pojmu zahrnována i první nebo druhá nástupnická generace, tedy situace, kdy se hybridi páří znovu navzájem nebo kdy dojde ke zpětnému křížení hybrida s některým z rodičovských druhů. Hybrid tedy nese podstatnou část DNA obou rodičovských forem.

Dobrým příkladem jsou třeba černí vlci žijící v Severní Americe. Považujeme je za normální vlky, ačkoliv své černé zbarvení získali velmi starými hybridizačními událostmi psů v dobách, kdy člověk se svými psy osidloval Ameriku. Až na barvu se ale jedná o zcela normální vlky, a nikoliv o hybridy. U vlčích mláďat feny v Ohrdrufu v Durynsku, která byla rovněž černá, byla však situace jiná, jednalo se o hybridy s 50 % podílem psí DNA.

 

Existují náznaky toho, že v Německu již byli vlci v minulosti vysazeni?

 

Ne, takové náznaky nejsou. Ale už se stalo, že došlo k úniku vlků z výběhů, například v Bavorském lese nebo naposledy v Knüllu, i toto jsou mediálně známé případy. Zvíře z obory v Knüllu bylo nakonec přejeto a identifikováno pomocí čipu, v tomto případě nebyla zapotřebí žádná další analýza DNA. V Bavorském lese bylo několik zvířat po určitou dobu prokázáno i ve volné přírodě, například v Rakousku. Jinak můžeme potvrdit, že vlci nebyli vypuštěni, protože vlci žijící v zajetí jsou geneticky výrazně jiní než naši volně žijící vlci, kteří se geneticky podobají vlkům ze severovýchodního Polska.

 

připravil Tobias Thimm

převzato z časopisu Wild und Hund 5/2020

Zpracování dat...